ZEL(e)NÉ LISTY

ROSTLINNÉ KULTURY IN VITRO II

Převod rostlinného materiálu do podmínek in vitro- sterilizace

V minulé části našeho miniseriálu jsme si přiblížili složení kultivačních médií a stručně jsme si popsali význam pro rostlinu v nich obecně zastoupených komponentů. Máme-li již připravené sterilní kultivační médium, můžeme se pustit do samotné přípravy rostlinného materiálu na převedení do podmínek in vitro. Zatím se spokojíme s konstatováním, že výchozím rostlinným materiálem může být celá rostlina (embryo ukryté v semeni) nebo část rostliny (orgán - kořen, stonek, pupen, list a někdy i květ) anebo jen části orgánů. Někdy je za tímto účelem využíváno dokonce jen několika buněk (pylová zrna). Správná volba výchozího materiálu je klíčová pro odvození vitální kultury in vitro a v příští části si vysvětlíme proč.

Při zvažování, jaký výchozí materiál zvolíme u  vybraného druhu, který chceme do podmínek in vitro přenést, , si musíme uvědomit, že materiál je zapotřebí nejprve sterilizovat, a to dokonale. Nesmí přežít jediný mikroorganizmus. Pro sterilizaci lze použít různé chemikálie- nejčastěji se požívá roztok Sava (chlornan sodný), či jiný dezinfekční prostředek na podobné bázi, nebo roztok  peroxidu vodíku, či líh. Někdy se volí postupné působení vícero dezinfekčních prostředků. Dříve se často používalo roztoků HgCl₂ či HgI₂ (0,1% roztoky), od čehož se ale vzhledem k toxicitě rtuti naštěstí upouští. Použití chemikálií s obsahem rtuti má ale stále své opodstatnění v případě sterilizace citlivějšího materiálu. Jedná se nicméně o látky volně nedostupné. Pro lepší smáčivost materiálu je dobré přidat do sterilizačního roztoku trochu detergentu, dobře poslouží například Jar nebo jiný mycí prostředek na nádobí (1 kapka). Každý rostlinný materiál je jiný, jinak citlivý a také jinak „zaneřáděný“. Vždy je proto nutné sterilizační proceduru optimalizovat pro konkrétní materiál. Na jedné straně nesmí materiál procedurou ztratit příliš mnoho na své vitalitě, ale na druhé straně musí mikroorganizmy svoji vitalitu ztratit zcela. Do hry tak vstupuje koncentrace daného sterilizačního prostředku, čas po který bude na materiál působit a také volba vlastního rostlinného materiálu.

Nejvíce si lze dovolit asi při sterilizaci generativních rostlinných propagulí- semen. Vždyť ta si rostliny vyvinuly mmj. pro překonávání dočasného působení nepříznivých vnějších podmínek, kterým i takový vodný roztok Sava jistě bude. Pro sterilizaci semen Ariocarpusů či Ferokaktusů se mi osvědčila například aplikace 30% roztoku Sava po dobu třiceti minut za stálého míchání. Následovalo trojnásobné opláchnutí semen ve sterilní destilované vodě (sterilizace destilované vody probíhá také autoklávováním viz. minule), které se běžně používá pro odstranění dezinfekčního činidla. Ne vždy ale máme k dispozici semena kýženého druhu, který chceme do podmínek in vitro přenést. Potom musíme vzít do rukou skalpel nebo nůžky a sterilizovat přímo vegetativní části rostliny. Ovšem občas nejsme v takové sterilizaci úspěšní, a to i přesto, že zabijeme veškeré mikroorganizmy přítomné na povrchu materiálu. Některé z nich mohou být přítomné hlouběji, v rostlinných pletivech, a na takové jsme krátcí. V lepším případě identifikujeme kontaminaci při kultivaci tohoto materiálu na médiu již po krátké době, často již po třech dnech kultivace. V horším případě se kontaminace projeví až po našem delším snažení, např. až po několikerém přenesení materiálu na čerstvé médium (tzv. pasážování). Také může kontaminace zůstat přítomna v materiálu v podobě tzv. latentní kontaminace, kdy se na daném kultivačním médiu mikroorganizmus množí v malé míře, takže jej nejsme běžně schopni identifikovat. Projeví se například až po přenesení materiálu na kultivačné médium jiného složení, které je vhodnější pro růst takového mikroorganizmu. Ve skutečně krajních případech lze využít služeb antibiotik, které přidáme do kultivačního média při jeho přípravě. Výhodou využití semen, coby výchozího materiálu (primárního explantátu), je právě to, že semena bývají uvnitř prosta mikroorganizmů a také dokonce i rostlinných virů.

Redukce počtu mikroorganizmů na povrchu semen lze docílit několikahodinovým propíráním semen v proudu vody, což umožní následně méně drastickou proceduru sterilizace a významně zvýší naše šance na úspěch. Pěstitelé sukulentů mají často výhodu v tom, že rostliny pěstované v sušším prostředí bývají méně „zaneřáděné“ mikroorganizmy než rostliny pocházející z vlhčího prostředí. Extrém představují rostliny z vodního prostředí. Každý jistě  tuší, že u částí rostliny, které byly v kontaktu s půdou, je šance na úspěch podstatně nižší, než u těch, které ve styku s půdou nebyly. Pokud jsme sterilizovali části rostlin, je nutné po sterilizaci odstranit skalpelem procedurou znekrotizovaná pletiva.

Po sterilizaci, ale i během sterilizace samotné, musíme pracovat s materiálem již jen ve sterilním prostředí a také veškeré nástroje musí být před použitím sterilní. Laboratoře, kde se kultivují rostliny v prostředí in vitro, mají velkou spotřebu aluminiové fólie (alobalu). Veškeré laboratorní sklo je alobalem uzavíráno (kádinky, Erlenmeyerovy baňky atd.) nebo do něj přímo baleno (Petriho misky). Na rozdíl od práce s nebezpečným mikrobiologickým materiálem, kde chráníme sebe a ostatní před daným materiálem, v tomto případě chráníme rostlinný materiál před námi a před naším počínáním. My osobně jsme zpravidla to, co lze v laboratoři označit za nejvíce (mikroorganizmy) kontaminovaný zdroj (tedy pokud tam neběhají nevymýtitelní cvrčci, jako u nás v laboratoři). Pro sterilní práci použijeme laminární flowbox viz. obr. Pracujeme v proudu sterilního vzduchu, který fouká rovnoměrně z celé vnitřní zadní plochy proti nám. Chceme-li si materiál položit na pracovní plochu, když ho chceme například rozřezat, tak si ve flowboxu sterilně otevřeme sterilní Petriho misku. Její víčko si otočíme  a položíme na pracovní plochu, a tím si tak vytvoříme hned dvě sterilní místa pro práci. Sterilní pinzetu či skalpel držíme tak, aby se nikdy nedostala do kontaktu s čímkoliv sterilním právě ta část, které jsem se již dotkli. Po použití nástroj ponoříme do lihu a nad kahanem zapálíme. Poté jej položíme na sterilní polovinu Petriho misky a po vychladnutí jej můžeme znovu použít. Cokoli se ocitne na sebemenší chvíli mimo box, je považováno za nesterilní. Stejně tak pokud cokoli nesterilního vložíme do sterilního proudu vzduchu ve flowboxu, tak vše, co se nachází po proudu tohoto vzduchu, je již považováno za nesterilní. Vždy se snažíme pracovat co nejhlouběji v boxu, tedy co nejblíže u zdroje proudu vzduchu. První chvíle ve flowboxu bývají u nováčků velmi náročné na soustředění, ale posléze se práce stává rutinou. Vždy, když jsem někoho tuto právi učil, tak se mi osvědčila pravítková metoda. Kdykoli se ruka blíží tam kam nemá, zasviští pravítko vzduchem.

Popsali jsme si tedy způsob, jak si sterilní materiál přeneseme na sterilní kultivační médium. V příští části si povíme, jaký rostlinný  materiál je nejvhodnější použít pro odvození rostlinných kultur v podmínkách in vitro nejen z hlediska úspěšné sterilizace, ale především z hlediska jeho potenciálu/ochoty následného růstu a vývoje v těchto podmínkách.  

Ondřej Skala

Fotografie:

1. + 2. Kontaminace kultury révy vinné

3. Flowbox