ZEL(e)NÉ LISTY

ROSTLINNÉ KULTURY IN VITRO I

K čemu je to dobré a složení kultivačních médií

Fotografie 1 - Kultivační místnost 

............................................................................

Pokud se v dnešní době člověk začne zajímat o rozličné způsoby množení rostlin, velmi často narazí na pojmy - explantátové či tkáňové kultury. Přestože lze o dané problematice na internetu dohledat mnohé, přeci jen si nemůžeme z časových důvodů dovolit dohledávat vše a souhrnný článek (review), navíc v češtině, často potěší. Doufám, že obdobné pocity vyvolá i toto malé seriálové review. Cílem článku je osvětlit problematiku explantátových kultur sukulentářské veřejnosti (prostému nadšenci) a vymezit možnosti jejího využití v sukulentářské praxi a to i v ryze domácích podmínkách.

Hovoříme-li o explantátové či tkáňové kultuře, nejedná se v podstatě o nic jiného, než o pěstování (kultivaci), případně o vegetativní množení (mikropropagaci) rostlinného materiálu za specifických umělých podmínek nastavených člověkem. Rostliny jsou pěstovány ve zcela sterilním prostředí, nepůsobí na ně tak svojí činností žádné jiné organizmy (především mikroorganizmy). Člověk může libovolně nastavit téměř všechny podmínky kultivačního prostředí a ty, které nemůže, má možnost alespoň monitorovat. Celým světem se tak pro rostlinu stává malá, často skleněná nádobka (nejčastěji Erlenmeyerova baňka). Z tohoto důvodu se historicky vžil pro celý proces název kultivace rostlin v prostředí  in vitro- tedy ve skle.

Pěstitel určuje volbou složení média (živné „půdy“) dostupnost a formu živin, vitamínů, vody a růstových regulátorů přístupných pro rostlinu. Dále také reguluje teplotu kultivačního prostředí, délku a kvantitu i kvalitu dopadajícího záření během dne. Právě tato definovatelnost kultivačního prostředí umožňuje studium mnohých základních fyziologických procesů v rostlině. Lze tak například studovat odpovědi rostlin na působení různých stresorů, regulaci kvetení, vývoj embryí a mnohem více. Molekulární genetika rostlin se bez tohoto nástroje v podstatě neobejde, bez něj bychom tak neměli geneticky modifikované rostliny/organizmy (GMO). V podmínkách in vitro lze kultivovat jak celistvé rostliny, tak jejich části – orgány (stonek, kořen, pupen), jejich části (pletiva), či jen samostatné buňky. My se v tomto review zaměříme především na jednotlivé způsoby mikropropagace rostlinného materiálu. Osvětlíme si například pojmy jako organogeneze či somatická embryogeneze. Nejprve si ale musíme daný rostlinný materiál přenést z normálních podmínek (ex vitro) do podmínek in vitro. K tomu potřebujeme především nejprve dvě věci- připravenou sterilní kultivační nádobku s kultivačním médiem a také vlastní sterilní rostlinný materiál (viz. příště).

Hlavní složkou každého kultivačního média, stejně tak, jako každé rostliny, je voda. Zbytek média můžeme rozdělit na dvě části - organickou a anorganickou. Rostlině musíme dodat živiny- ionty. Ve formě solí dodáváme do média makrokroprvky (N, K, Ca, Mg, P, S) i mikroprvky (Cl, B, Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Ni). Každá rostlina, či její část, vyžaduje pro svůj optimální růst a vývoj specifické zastoupení iontů. První složení média definovali Murashige a Skoog (1962) a podle nich bylo médium pojmenováno jako MS médium. Dnes máme k dispozici nepřeberné množství médií, která se liší nejen ve složení své anorganické, ale i organické části. V mnoha případech není rostlina při kultivaci v podmínkách in vitro soběstačná v syntéze látek, které jsou esenciální pro její růst a vývoj. Vždyť často pěstujeme v podmínkách in vitro pouze části rostlin. Mohou tak chybět právě ty části, ve kterých je látka v celistvé rostlině syntetizována atp.. Proto je dobré přidávat do médií některé vitamíny (nejčastěji thiamin, pyridoxin, kyselina nikotinová), nebo některé aminokyseliny (např. glutamin, glycin), či myo-inositol. I u těchto látek existují specifické nároky u jednotlivých rostlinných druhů nebo kultivovaných částí rostlin. Je proto nutná optimalizace složení média pro konkrétní rostlinný materiál. Vybrané rostliny vyžadují dodání dalších látek, např. nukleových kyselin, či jejich prekurzorů, které jim mohou být do médií „servírovány“ v netradiční podobě, jako je kokosové mléko či ananasový džus. Tím se vyznačují například mnohé druhy orchideí. Samostatnou kapitolu tvoří cukry dodávané do médií. Kultury in vitro, i ty, které jsou zelené a fotosyntetizují, nejsou z  hlediska pokrytí svých energetických potřeb soběstačné. Forma a koncentrace cukru v médiu je velmi důležitá. Nejčastěji je dodávána sacharóza (kuchyňský cukr). V některých případech je ale vhodnější dodání maltózy, jindy glukózy a jindy galaktózy. To může být vývojově závislé. Například rostoucí rostlinné embryo může preferovat jiný sacharid než plně vyvinuté dozrávající embryo. Vedle zdroje energie a uhlíkových řetězců (dříve uhlohydráty), jsou sacharidy osmotikem (ovlivňují vodní poměry v rostlinné buňce - vzpomeňte na kandované ovoce jako extrém) a v neposlední řadě jsou zdrojem signálů v rostlině, které výrazně ovlivňují růst a vývoj rostliny. Mluvíme-li o sacharidech, neměli bychom opomenout jeden velmi důležitý polysacharid pro kultury in vitro – agar. Tento polysacharid, původem z mořských řas, rostliny neumějí štěpit a využívat. Jeho hlavní funkcí je ztužení médií do formy „želé“. Rostlina se tak může v médiu snadno uchytit, zakořenit a zorientovat v prostoru.

Pokud chceme namnožit určitý rostlinný materiál v podmínkách in vitro, neobejdeme se zpravidla bez růstových regulátorů (RR) dodaných do kultivačních médií. Jedná se o uměle připravené látky se stejnými či obdobnými účinky na rostliny, jako mají látky s regulační povahou, které se v rostlině přirozeně vyskutují (fytohormony). Pro tyto látky je typické, že narozdíl od výše zmíněných sacharidů působí při velmi nízkých koncentracích. Mezi pět hlavních fytohormonů/RR řadíme auxiny (auxein = růsti, podpora zakořeňování, podpora apikální dominance), cytokininy (cytos = buňka, kineze = pohyb, tedy podpora buněčného dělení; zmírnění apikální dominance, tedy prorůstání úžlabních pupenů), ABA (kyselina abscisová; převážně navozuje dormanci, klidový stav, opad listů (=abscise), ale má i nezastupitelnou roli např. v regulaci embryogeneze některých rostlin), gibereliny (dlouživý růst, podpora klíčení semen) a etylén (stimulace opadu listů, urychlení zrání některých plodů).

Ze zde uvedeného je jasné, že médium představuje velmi složitý systém. Aby byl schopen rostlinný materiál z tohoto prostředí látky přijímat, musí mít médium správné pH, které se pohybuje nejčastěji kolem hodnoty 5,8. Toho lze docílit úpravou pomocí KOH či HCl. Je zde nutné zmínit, že během kultivace rostlinného materiálu dochází ke změnám složení média, rostlina látky z média přijímá a jiné do něj vylučuje. Ze strany rostliny se nejedná pouze o exkreci odpadních látek, ale i např. o látky, které rostlině zpřístupňují některé složky média. Nicméně po jistém časovém intervalu kultivace je nutné přenesení materiálu na médium čerstvé (zpravidla týdny, ale i měsíce). Délka tohoto intervalu je opět dána materiálem- např. mírou jeho metabolizmu, nebo požadavkem na dodání určité látky do média, pokud má dojít ke změně v růstu a vývoji daného materiálu. Po přípravě média je nutná jeho sterilizace nejčastěji již v kultivačních nádobkách, která probíhá zpravidla klávováním v autoklávu při 121°C a tlaku 0,144 MPa po dobu dvaceti minut.

Tím jsme si představili všechny důležité hráče, kterými můžeme na kultivovaný rostlinný materiál působit a ovlivňovat jej. Příště nám tak nic nebrání, abychom rozehráli vlastní představování zajímavější a zábavnější problematiky explantátových kultur. V případě jakýchkoliv dotazů nebo požadavků na detailnější informace týkající se dané problematiky se mi prosím neostýchejte položit dotaz. Budu-li znát odpověď, rád jej zodpovím.    

Ondřej Skala   

Fotografie 2 - Yavia