ZEL(e)NÉ LISTY

ROSTLINNÉ KULTURY IN VITRO

Shrnutí a ekonomická stránka věci

V minulých částech našeho povídání jsme si představili obecnou problematiku rostlinné mikropropagace. Vysvětlili jsme si, že tato metoda je založena na rozšíření spektra podmínek prostředí, ve kterých lze rostliny pěstovat. Specifické podmínky in vitro (sterilní prostředí, vysoká vzdušná vlhkost, přítomnost růstových regulátorů) nám umožňují rozvíjet okrajové jevy v chování rostlin.

Množení rostlin v podmínkách in vitro má ve srovnání s konvenčními metodami mnohé výhody. Materiál lze namnožit rychle a efektivně, nezávisle na ročním období a výsledkem může být i zcela patogenu-prostý materiál. Tím je možné i redukovat problémy spojené s pohybem daného materiálu přes hranice. V podmínkách in vitro lze namnožit materiál, u kterého selhaly veškeré běžné způsoby množení, ať už se jedná o rostliny vyskytující se přirozeně v přírodě, nebo o různé zajímavé uměle vytvořené či vyselektované mutanty. Ovšem nesmíme zapomínat na to, že mikropropagací jsou produkovány identické klony. Proto bude vždy nutné množit materiál s různým genetickým základem a jeho následné pečlivé značení, aby byla zachována určitá genová variabilita a také případná možnost generativního množení.

Je nutné si uvědomit, že dlouhodobá kultivace rostlin v podmínkách in vitro vede k selekci rostlin/materiálu, kterým/kterému toto prostředí a způsob množení prospívá. Takto selektovaný materiál nemusí být vždy právě ten nejhodnotnější, kterému se poté bude dařit v podmínkách ex vitro. Navíc materiál nezůstává během dlouhodobé kultivace neměnný. Dochází ke změnám na úrovni genetické (mutace), ale také epigenetické, kdy není změnami zasažena přímo genetická informace v podobě vlastní DNA. Zde, velmi zjednodušeně řečeno, dochází jistými vratnými chemickými změnami v okolí DNA ke změnám přístupnosti některých jejích částí. Mění se tak i chování daného rostlinného materiálu. Zvyšuje se jeho heterogenita v odpovědi na dané podmínky. Časem například embryogenní kalus (či embryonálně suspenzorová hmota) ztrácí svůj embryogenní potenciál.

Vedle doposud popisované mikropropagace představuje kultivace rostlin v podmínkách in vitro velmi mocný nástroj, využívaný například při zachování genetických zdrojů (budování genobank, uchovávání hodnotného materiálu ve zmrazeném stavu = kryoprezervace, při -196°C). Kultivace rostlin in vitro je zde důležitá pro samotnou přípravu rostlinného materiálu (tím mohou být například meristematická centra) a posléze v procesu náročného „znovuoživení“ a následného množení. Dále také pro získání viruprostého materiálu (ozdravování materiálu), kdy se buďto materiál ošetřuje teplem, nebo případně jsou přednostně množeny ty části rostlin, ve kterých je výskyt patogena v rostlině obecně nejmenší (naoř. oblast vzrostného vrcholu) a postupně růstem dochází k „vyředění“ patogena z tohoto materiálu.

Nelze nezmínit využití kultur pro získávání různých látek důležitých pro farmacii (produkce sekundárních metabolitů)- např. získávání cytostatika taxolu, nebo resveratrolu (látka odpovědná za pozitivní účinky vína). Umělou kultivací určitých buněk tisu za specifických podmínek v podmínkách in vitro lze docílit podstatně vyššího výtěžku taxolu než v přírodě. Nelze také opomenout, že se jedná o nástroj důležitý pro odvození celistvých rostlin z buněk, u nichž byla člověkem uměle pozměněna DNA (tj. odvození celistvé GMO = geneticky modifikované organizmy).

Je-li vynechán při přípravě média ztužující agar, získáme tzv. tekuté médium. Materiál můžeme kultivovat buďto ponořený v tekutém médiu, nebo případně částečně ponořený, pokud využijeme různých plovoucích prámků. Výhoda této kultivace spočívá v dobré přístupnosti jednotlivých složek média pro rostlinný materiál. Ovšem v případě sebemenší kontaminace je současně kontaminován veškerý materiál v kultivační nádobce. Navíc odhalení kontaminace v tekutém médiu (zákal) je podstatně obtížnější než v případě pevných médií. Maximální efektivity v mikropropagaci lze dosáhnout za využití bioreaktorů. V bioreaktorech lze kontinuálně monitorovat a měnit kultivační podmínky v tekutém médiu a a materiál kultivovat téměř bez lidské manuální práce. Výsledkem jsou poté somatická embrya. V biorektorech lze kultivovat také kultury, které vylučují do média sekundární metabolity (viz. výše). Tyto látky lze z bioreakoru kontinuálně odseparovávat.

No a kolik to všechno stojí? Pro práci v podmínkách in vitro je potřeba určité vybavení, které lze více, či méně nahradit pro domácí neprofesionální účely (někdy ovšem s velmi nejistým výsledkem). Nezastupitelným vybavením jsou analytické (přesné) váhy (nové mezi 20 a 30 tisíci). Koncentrace RR v médiích jsou velmi nízké a jejich dávkování musí být bezpodmínečně přesné. Běžné automatické nastavitelné laboratorní pipety (cca od 3500 Kč/kus) lze při obrnění se notnou dávkou trpělivosti nahradit starými skleněnými „prehistorickými“ pipetami. Nový pH metr lze sehnat od cca 2500 Kč, lze jej nahradit indikátorovými papírky. Kultivační nádobky s médiem (obyčejná zavařovačka se šroubovacím uzávěrem splní účel dokonale, nejlepší jsou staré od přesnídávek), se sterilizují v autoklávu za definovaných podmínek - 20 minut při 121 °C a 2 atmosférách. Pro domácí účely lze autokláv do jisté míry nahradit kuchyňským papiňákem. Ovšem je nutno počítat s tím, že mnohé složky média mohou při odchýlení se od popsaných podmínek degradovat, čili pokaždé bude výsledkem jiné složení média. Ale pro amatérské využití může být toto dostatečné (ceny nových klávů rozumných rozměrů pro využití v neprofesionální laboratoři se pohybují od cca 80 000 Kč směrem nahoru, u klávu pro profesionálnější použití už váháte mezi koupí klávu nebo auta nižší střední třídy). Co se týče flowboxu, tak přestože se jedná o principielně velmi jednoduché filtrační zařízení, dnešní flowboxy jsou již celkem sofistikovaná zařízení, a proto je nutno počítat s vyšší pořizovací cenou. Cena roste s velikostí pracovní plochy, kterou pro práci potřebujeme, nebo si chceme dopřát. Ceny začínají opět na cca 80 000 Kč, ale za rozumný flowbox zaplatíte už od 145 000 Kč výše. Toto zařízení lze (bohužel) značně neuměle pro domácí účely nahradit hrncem s vařící vodou, kde se pracuje nad hrncem v unikající sterilní páře. Nezkoušel jsem, ale bude to postup asi jen pro osoby velmi manuálně zručné. Dále potřebujete samozřejmě laboratorní sklo, chemikálie a nástroje (pinzety, nůžky, skalpely). Dnes si lze již objednat hotová namíchaná „instantní“ média, do kterých dodáte vodu, růstové regulátory a agar. Bylo by asi vhodné zmínit, že 1 kg „lepšího“ agaru může stát až 13 000 Kč bez DPH (obyčejně dávka 6 g/l média a 25 ml média/nádobka).

Vše je sice drahé (každá zábava něco stojí), ale velmi zajímavé. Pokud vládnete alespoň základoškolskými znalostmi chemie, nic kromě trochy praxe, alespoň doufám, vám již nyní nebrání…

Ondřej Skala

Poznámka ZL: pokud bude mít právě skončený seriál nějaký ohlas čtenářů, kteří budou mít konkrétní dotazy nebo potřebu dalších rad k „in vitro“ pokusům, je pravděpodobný nějaký praktický přídavek , např. ve formě dotaz – odpověď.